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）是一种全身性骨代谢疾病，其特征主要表现为骨量减少和骨微结构退化，进而导致骨脆性增加和骨折风险升高。该病的主要病理机制在于骨吸收与骨形成失衡。因此，维持骨稳态是预防和治疗、雌激素和甲状旁腺激素等。然而，长期使用上述药物可能伴随多种不良反应。如双膦酸盐可能导致胃肠道不耐受
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的病理基础，其特征是动脉腔硬化和狭窄以及斑块的形成[6]。近年来，AS的发病率持续上升，已成为心血管相关疾病死亡的主要诱因[7]。研究表明，全球每年约有2 000万人死于AS相关并发症，且患病群体呈现年轻化趋势，这对人类健康造成严重威胁。因此，AS的防治已成为医学研究的重点和难点[8-9]。近年来研究发现，AS与OP之间存在密切的联系。临床观察及流行病学数据显示，与骨量正常人群相比，低骨量及OP患者并发心血管疾病的风险显著升高，尤其是冠状动脉疾病和脑卒中的发生率明显上升[10]。这一现象提示OP与AS之间可能存在潜在的病理生理关联。研究也发现，血脂异常是OP与AS的共同危险因素[11]。脂代谢紊乱可通过干扰成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡，破坏骨代谢稳态，进而引起骨密度下降与骨微结构损伤，最终促进骨质疏松的发生与发展[12-13]。同时，脂质代谢紊乱也参与AS及脑血管疾病的发病过程，它促使脂质在动脉壁内异常积聚，是动脉斑块形成的核心始动环节[14]。因此，调节血脂、改善脂质沉积被视为防治OP合并AS的重要策略之一。值得关注的是，部分心血管药物对骨骼代谢亦表现出积极作用。如他汀类药物除具有调血脂作用外，还能促进骨形成。然而，目前在临床实践中，能够明确增加骨密度并降低骨质疏松性骨折风险的心血管药物仍主要局限于他汀类，其他类型药物尚缺乏足够的证据支持[15]。因此，进一步研发既能改善脂代谢又能抑制骨质疏松的药物，是提高老龄化社会健康水平的关键问题之一。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是一种配体激活的核转录因子，最初被证实是调控脂肪细胞分化的关键因子，后续研究发现其在葡萄糖稳态和脂质代谢等过程中也发挥重要调控作用[16]。研究表明，PPARγ可直接调控原癌基因Fos（fos proto-oncogene，c-Fos）基因的表达，南宫28下载其配体激活后可显著促进破骨细胞分化和骨吸收功能。核受体家族成员雌激素相关受体α（estrogen-related receptor α，ERRα）作为PPARγ的下游靶基因，与PPARγ共同参与代谢调控。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1β（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1β，PGC-1β）作为PPARγ和ERRα的共同转录激活因子，不仅能增强线粒体生物合成，还能显著提高破骨细胞活性。这提示PPARγ、ERRα和PGC-1β通过形成复杂的转录调控网络，协同调节机体脂质代谢平衡和骨稳态[16]。
玄参Scrophulariae Radix为我国传统常用中药材，为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，是著名中药材“浙八味”之一，在浙江、四川、湖北等地广有栽培，具有清热凉血等功效[17]。哈巴苷是玄参主要的环烯醚萜苷类成分之一，具有重要的生物活性。研究表明，哈巴苷具有神经保护、提高耐缺氧能力、保护血管内皮细胞和抑制血小板凝聚等作用[18-19]。哈巴苷通过下调骨髓细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）和c-Fos蛋白表达而抑制核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）诱导的破骨细胞分化[20]。然而，哈巴苷对AS诱发的血脂代谢紊乱和骨吸收异常的作用以及其潜在的作用机制目前尚未见报道。因此，本研究选用高脂饮食诱导的AS模型小鼠，探讨哈巴苷对其血脂代谢和骨代谢的影响及其潜在的作用机制，以期为哈巴苷在AS合并OP的临床应用提供理论依据。
参考徐天舒等[21]的方法构建AS小鼠模型，简述如下：ApoE−/−小鼠给予高脂饲料喂养8周后，随机分成模型组、阿托伐他汀（2.6 mg/kg）[22]组和哈巴苷（20 mg/kg）[23]组，每组8只。另取8只C57BL/6N野生型小鼠作为对照组，全程给予普通饲料喂养。给药组ig以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制的相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续给药9周。给药过程中每周称量1次小鼠体质量。
实验结束时，小鼠禁食不禁水12 h后，ip 1%戊巴比妥钠麻醉，进行腹主动脉取血，血液静置后，4℃、3 500 r/min离心15 min，取上清，保存于−80℃冰箱中备用。取两侧股骨和胫骨，剔除肌肉组织，将一侧股骨保存于70%乙醇中，另一侧股骨固定于4%多聚甲醛溶液72 h后，用10%乙二胺四乙酸二钠溶液（disodium edetate，EDTA）脱钙1.5个月，每周更换1次。
将股骨骨髓冲洗干净后，在研钵中加入液氮将其研磨呈细粉状，放入烘箱烘干。再将制备好的股骨样本放置在傅氏转换红外线光谱仪中，进行扫描分析。设置空间光谱分辨率为6.25μm，扫描范围为4 000～400 cm−1。利用origin软件解谱分析，得到以下参数：（1）矿化程度（矿物质与基质峰面积比）：磷酸盐峰（波长900～1 200 cm−1）和酰胺I峰（波长1 592～1 712 cm−1）的面积比；（2）胶原蛋白交联比：波长1 660 cm−1和1 690 cm−1的强度比；（3）碳酸盐与磷酸盐比值：碳酸盐峰（波长850～890 cm−1）和磷酸盐峰（波长900～1 200 cm−1）的面积比。
参考戴璇等[24]的方法，将脱钙后的股骨制成石蜡切片，置于60℃烤箱中2 h，然后依次经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，随后经苏木素染色3 min，再放入1%盐酸乙醇中进行分色，用伊红染色3 min，然后脱水透明、封片，于显微镜下观察股骨的病理变化并拍照记录。
取骨组织石蜡切片，进行脱蜡和复水处理。然后滴加配制好的TRAP工作液覆盖组织，将其置于37℃烘箱中避光孵育30 min。弃去孵育液，水洗，再将样品进行脱水和透明处理。最后，使用中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。
按照试剂盒说明书检测血清中TRAP、CTX-1、TC、HDL-C和LDL-C水平，并计算AS指数。
称取100 mg胫骨组织，加入裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。分别取50 μg样品与上样缓冲液混合均匀，100℃加热8 min使蛋白变性。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜，再置于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，分别加入NFATc1（1∶1 000）、c-Fos（1∶5 000）、cathepsin K（1∶500）、PGC-1β（1∶1 000）、ERRα（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、α-Tubulin（1∶1 000）和β-actin（1∶20 000）抗体，4℃孵育过夜；次日，用TBST洗膜后，分别加入相应的二抗，室温孵育1 h，使用ECL发光液显色，采用凝胶成像仪拍照，利用Image J软件对条带进行半定量分析。
如图1-A所示，与对照组比较，给药第2周时模型组小鼠的体质量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠的体质量无明显变化。如图1-B～E所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中LDL-C、TC、HDL-C水平和AS指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中LDL-C、TC、HDL-C水平和AS指数均显著降低（P＜0.05、0.01）。这表明哈巴苷能改善AS小鼠的血脂代谢。
如图2-A～I所示，与对照组比较，模型组小鼠表现出显著的骨微结构损伤和BMD下降，表现为骨小梁结构稀疏、变细、间距加宽、数目减少，其BMD、BS/TV、Tb.Th、Ct.Ar、BV/TV、Tb.N、Ct/Th均显著降低（P＜0.01），DA显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组小鼠的骨小梁丢失程度有所改善，其BMD、BS/TV、Tb.Th、Ct.Ar、BV/TV、Tb.N、Ct/Th均显著升高（P＜0.05、0.01），DA显著降低（P＜0.05、0.01）。这表明哈巴苷可以抑制AS小鼠骨微结构的破坏，从而改善骨质量。
为了进一步探索AS与OP的关系，将模型组小鼠的脂代谢相关指标、AS指数与BMD进行Pearson相关分析，结果如图2-J～M所示，LDL-C、TC、HDL-C、AS指数与BMD呈负相关（P＜0.05），这提示脂代谢紊乱能促进AS与OP的发生和发展。
如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠胶原蛋白交联比和骨矿化程度显著降低（P＜0.05、0.01），碳酸盐与磷酸盐比值以及磷酸盐取代显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，哈巴苷组小鼠胶原蛋白交联比和骨矿化程度显著升高（P＜0.05、0.01），碳酸盐与磷酸盐比值以及磷酸盐取代显著降低（P＜0.01）；阿托伐他汀组小鼠骨矿化程度显著升高（P＜0.05），碳酸盐与磷酸盐比值以及磷酸盐取代显著降低（P＜0.05、0.01）。这表明哈巴苷可以改善AS小鼠的骨材料特性。
各组小鼠股骨HE染色结果（图4-A）所示，与对照组比较，模型组小鼠的骨小梁稀疏、不连续；与模型组比较，给药组小鼠的骨小梁的形态有一定的改善。各组小鼠股骨TRAP染色结果（图4-B）显示，与对照组比较，模型组小鼠骨组织破骨细胞阳性紫红色区域明显增多；给予哈巴苷和阿托伐他汀干预后，可在一定程度上抑制这一改变。这表明哈巴苷可以改善AS小鼠骨组织病理形态学，减少破骨细胞的数量，抑制骨吸收。
血清中TRAP和CTX-1的水平是反映小鼠骨吸收状态的特异性指标。如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中TRAP和CTX-1的水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中TRAP和CTX-1的水平显著降低（P＜0.05、0.01）。这表明哈巴苷可以抑制AS小鼠的骨吸收。
本研究主要探究哈巴苷对AS小鼠骨吸收的影响。此外，已有研究表明阿托伐他汀通过调节NFATc1信号通路抗OP[25]，因此，以下研究重点探索哈巴苷对骨代谢和脂代谢相关因子的作用。采用Western blotting检测各组小鼠骨组织中骨吸收相关蛋白c-Fos、NFATc1和cathepsin K的表达水平，结果如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠骨组织中骨吸收相关蛋白c-Fos、NFATc1和cathepsin K的表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，哈巴苷组小鼠骨组织中骨吸收相关蛋白c-Fos、NFATc1和cathepsin K的表达水平显著降低（P＜0.01）。这表明哈巴苷可以下调AS小鼠骨组织中骨吸收蛋白的表达水平，进而抑制骨吸收，南宫28下载改善骨质量。
3.7哈巴苷抑制AS小鼠骨组织中PPARγ/ERRα/ PGC-1β信号通路相关蛋白表达
为了进一步研究哈巴苷对AS小鼠脂代谢及骨代谢的机制，采用Western blotting检测各组小鼠骨组织中PPARγ/ERRα/PGC-1β信号通路相关蛋白的表达水平，结果如图7所示，与对照组比较，模型组小鼠骨组织中PPARγ、ERRα和PGC-1β的蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，哈巴苷组小鼠骨组织中PPARγ、ERRα和PGC-1β的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。这表明哈巴苷可能通过抑制AS小鼠骨组织中PPARγ/ERRα/ PGC-1β信号通路，从而改善脂质代谢和抑制骨吸收，进而改善骨质量。
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